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pcr过程中加入模板的量是多少

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同一物种,标准曲线用cDNA测得 , 做PCR时,如果DNA模板中的一条序列是
5'ACATCGCT..........GTACCTAC3',那它的两个引物是什么?为什么?
初学者,对这儿不太明白
引物不是应该跟DNA链碱基互补吗?而且是不是还要考虑到复制的顺序吗? , 引物是否只与首末端结合,详细原因 ...

聚合酶和模板的量会影响pcr突变的结果么?: pcr突变主要是酶造成的,用高保真酶可以保证突变非常少也可能没有突变

荧光定量PCR的模板可以是DNA吗?内含子对其有无影响?: 在实时荧光PCR中。模板的定量有2种方法:绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数;
相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化.
如果你做的是DNA的定量,可以用DNA 模板。你用质粒作为标准品做标准曲线,最后可以换算出来拷贝数,这是绝对定量。

如果是做转录,表达量的变化,需要提取RNA,反转录为cDNA,然后再做相对定量。

做PCR时,如果DNA模板中的一条序列是 5'ACATCGCT..........GTACCTAC3',那它的两...: 首先,要考虑到DNA是双链的,那么,另外一条链就是3'TGTAGCGA.........CATGGATG5'。接下来,我们要设计的引物是5‘到3’的,那么针对你写的那条链,我们设计5‘到3’的引物要与右侧的互补,为5‘GTAGGTAC3',其实正好与互补链一样,然后,针对我写的这条互补链,他的计5‘到3’的引物便要与左侧的互补了,为5’ACATCGCT3'。
其实简单说就是上游引物就是模板链的5‘到3’,下游引物是其互补链的5‘到3’,当然了具体的引物位置要根据你的需要了。下面的就是模板链的格式:
5'ACATCGCT..........GTACCTAC3'
3’TGTAGCGA.........CATGGATG5'

以基因为模板,pcr方法获得基因,运用puc18载体说明克隆和筛选过程: 根据基因,用Primer Premier 5 软件设计引物合成引物。利用高保证酶进行PCR扩增,扩增产物经纯化或胶回收得到目的片段。将目的片段、载体、Buffer按使用说明混合均匀过夜。经转化(重组载体加入感受态细胞,冰浴30min,42度热激90s,加入LB培养1.5--2h,收集菌体涂平板)14-16h后挑取单克隆培养4-6h后即可通过PCR进行阳性克隆的检测。

PCR扩增出现片状拖带或涂抹带可能是什么原因?:

原因                                            建议

模板DNA,模板不纯:纯化模板或使用试剂盒提取DNA

   

耐热聚合酶,酶量过多:以0.5U为间隔适当减少酶量

   

Mg2+浓度,Mg2+浓度过高:适当降低Mg2+浓度,从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。

   

dNTP,dNTP浓度过高:适当降低dNTP浓度

   

退火温度,退火温度过低:适当提高退火温度

   

PCR循环次数,PCR循环次数过多:减少PCR循环次数

   

PCR中引物是怎样引入的(与特定模板链结合): 这要看你所设计的引物了,引物不同,它结合的位置也不同。在PCR中,94度的变性使DNA双链成为单链,50度左右的复性使引物结合到模板链上,复性温度要根据引物的Tm值。所以引物不是说只与首末端结合。

看我的PCR扩增产物跑的电泳,其中一个为什么没跑出来,怎么判断DNA模板是不是有问题: 电泳图为什么没贴上来?
没跑出来的因素很多。别的都有就这一个没有的话,首先考虑肯定是模板有没有问题。其次机器和试剂还有PCR管是不是够干净或者够稳定。最后考虑有没有加错。
要判断模板有没有问题,你就按照之前的试验方案,就拿这一个样品,做梯度试验,做三四个样就可以了吧,同时拿上次做出来了的做对照。如果这次能出来,就说明模板没问题,是别的原因。如果还没有,就考虑模板有问题了。

用CTAB法提取到的植物基因组DNA做模板PCR总是失败,如何纯化?: 首先,你先确定你用CTAB法提取植物基因组的DNA是否提取出来,你的胶上DNA的亮度如何?

如果肯定你的DNA没有问题的话,是不是你的引物有问题?之前有用过同种引物吗?引物的退火温

度是否正确?PCR出不来,是有很多原因的,不是单纯的DNA的问题。

你先琼脂糖检测DNA是否有问题?如果DNA没有问题的话,再去看你引物的问题,是不是合适的引物?
如果引物也是对的,再看一下退火温度。

希望对你有帮助,请采纳!

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